现代毒理学的研究方法,由于其本身包括众多的分支学科,分别在相应的学科领域里建立了自己的研究方法,现归纳为两大类。(一)实验研究(微观研究)动物实验的方法仍是现代毒理学实验的重要方法之一,传统的毒理学通过整体动物实验已为人类提供了大量的以剂量-效应(反应)为主的数据库,结合人群接触水平对许多化学物质进行了安全性(危险度)评价。
由于外源物的数量巨大,整体动物实验需要消耗大量的时间和经费,也不能满足数以万计的外源化学物质的毒性评价要求,另一方面为了保护动物,尽量减少动物的使用,所以由过去以整体动物试验占主导地位的观念,转向以体外试验为主导地位的趋势。但也需指出,体外试验的发展并不排斥整体实验的重要性,两者相互补充,互为验证才能为科学研究提供可靠数据,随着生命科学的发展,分子生物学的理论及技术被引入现代毒理学,近年来在分子水平上建立了许多新方法。
1.体内试验
哺乳动物体内试验,也称整体动物实验,一般包括:急性毒性试验、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验及慢性毒性试验。还有特殊毒性实验,如哺乳动物致突变试验、致畸试验、致癌试验。以上试验在毒理学中统称“三性”和“三致”试验。
常用的试验动物:大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、家兔、狗、猴等。检测环境污染物的毒性试验,常选用鱼、蚤类或其他水生生物。还可用鸟类、昆虫进行试验。
近年来为了从分子水平探讨致突、致癌机制,转基因动物已开始在毒理学试验中应用。
转基因动物是一种集整体水平、细胞水平和分子水平于一体的实验动物,更能体现生命整体研究的效果,它是把经典的与现代的毒理学研究方法相结合,无疑会推动现代毒理学实验研究的发展。
2.体外试验
利用游离器官、培养的细胞、细胞器以及利用微生物等进行毒性研究的方法为体外试验,此方法多用于观察外源物对生物体特殊毒性的初步筛检及作用机制和代谢转化过程的深入研究。
体内与体外试验各有优点和局限性,应根据试验目的和要求,选择一组试验,才能互相弥补优缺点。(二)人群调查(宏观研究)人群调查也称为人群毒理学,是在人群中研究外源物对人体产生毒作用的规律,为人群检测和制订预防措施提供比动物试验更直接更可靠的毒理学资料,主要包括以下3个方面:
1.中毒临床观察
常见于偶然发生的事故,如误服、自杀、毒性灾害等,通过急性中毒事故的处理和治疗,可直接观察到中毒的症状并分析可能的毒效应的靶器官。
2.志愿者试验
在不损害人体健康的原则下,有时可设计一些不损害人体健康的受控试验,仅限于低剂量、短时期的接触毒性作用可逆的化学品,目前国际上提倡健康志愿者的毒性试验,减少由动物试验结果外推于入的不确定性,特别是一些神经毒物出现的毒性效应,如头晕、目眩、复视等需要表达的中毒症状,只有人才能真实地反映出来,所以国外健康志愿者的毒理学研究资料倍受重视。
3.流行病学调查
将动物试验的结果,进一步在人群调查中验证,可以从人群的直接观察中,取得动物试验所不能获得的资料,优点是接触条件真实,观察对象是一个大的群体,为人群检测和防治措施提供比动物试验更直接、更可靠的科学资料,但是也存在许多难点:①人群中观察外源物的毒性效应大多数为慢性毒性效应,特别是人类致癌物质其致癌效应所需时间过长;②接触人群中所用的观察指标是非特异性的,与对照人群比较需要足够例数:③外环境因素混杂,外源物的种类繁多而且多种化学物质可出现联合作用,难以确定某种特定的化学物质毒性效应和其因果关系。
近年来由于分子生物学的发展和渗透,在传统流行病学调查方法中引进了细胞、分子水平的人群检测方法,如生物标志物作为癌症早期判断的信息,把分子生物学与流行病学结合为一体发展为分子流行病学。这门新兴学科利用分子生物学、分子遗传学、生物化学、免疫学等手段研究,评价不同人群或个体致癌危险度及其机制,从而使现代毒理学由实验动物研究发展到人群和个体易感性研究的新阶段。
它可以解答人体从接触化学物质到发生疾病的过程中所发生的一系列连续性的变化,从中提取更多的癌前病变的信息,为癌症的早期判断、早期防治提供科学依据。可以预测,分子流行病学在21世纪将会得到更大的发展。
综上所述,正确的方法是将宏观研究与微观研究有机地结合起来,宏观研究为微观研究提供线索,微观研究为宏观研究提供依据,两者结合起来才能对外源化学物质作出准确的危险度评价。
农药蚯蚓毒性测试是什么?
第一章 总则第一条 为了保证兽药的安全、有效和质量,规范兽药研制活动,根据《兽药管理条例》和《病原微生物实验室生物安全管理条例》,制定本办法。第二条 在中华人民共和国境内从事新兽药临床前研究、临床试验和监督管理,应当遵守本办法。第三条 农业部负责全国新兽药研制管理工作,对研制新兽药使用一类病原微生物(含国内尚未发现的新病原微生物)、属于生物制品的新兽药临床试验进行审批。
省级人民政府兽医行政管理部门负责对其他新兽药临床试验审批。
县级以上地方人民政府兽医行政管理部门负责本辖区新兽药研制活动的监督管理工作。第二章 临床前研究管理第四条 新兽药临床前研究包括药学、药理学和毒理学研究,具体研究项目如下:
生物制品(包括疫苗、血清制品、诊断制品、微生态制品等):菌毒种、细胞株、生物组织等起始材料的系统鉴定、保存条件、遗传稳定性、实验室安全和效力试验及免疫学研究等;
其它兽药(化学药品、抗生素、消毒剂、生化药品、放射性药品、外用杀虫剂):生产工艺、结构确证、理化性质及纯度,剂型选择、处方筛选,检验方法、质量指标,稳定性,药理学、毒理学等;
中药制剂(中药材、中成药):除具备其它兽药的研究项目外,还应当包括原药材的来源、加工及炮制等。第五条 研制新兽药,应当进行安全性评价。新兽药的安全性评价系指在临床前研究阶段,通过毒理学研究等对一类新化学药品和抗生素对靶动物和人的健康影响进行风险评估的过程,包括急性毒性、亚慢性毒性、致突变、生殖毒性(含致畸)、慢性毒性(含致癌)试验以及用于食用动物时日允许摄入量(ADI)和最高残留限量(MRL)的确定。
承担新兽药安全性评价的单位应当具有农业部认定的资格,执行《兽药非临床研究质量管理规范》,并参照农业部发布的有关技术指导原则进行试验。采用指导原则以外的其他方法和技术进行试验的,应当提交能证明其科学性的资料。第六条 研制新兽药需要使用一类病原微生物的,应当按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《高致病性动物病原微生物实验室生物安全管理审批办法》等有关规定,在实验室阶段前取得实验活动批准文件,并在取得《高致病性动物病原微生物实验室资格证书》的实验室进行试验。
申请使用一类病原微生物时,除提交《高致病性动物病原微生物实验室生物安全管理审批办法》要求的申请资料外,还应当提交研制单位基本情况、研究目的和方案、生物安全防范措施等书面资料。必要时,农业部指定参考试验室对病原微生物菌(毒)种进行风险评估和适用性评价。第七条 临床前药理学与毒理学研究所用化学药品、抗生素,应当经过结构确证确认为所需要的化合物,并经质量检验符合拟定质量标准。第三章 临床试验审批第八条 申请人进行临床试验,应当在试验前提出申请,并提交下列资料:
(一)《新兽药临床试验申请表》一份;
(二)申请报告一份,内容包括研制单位基本情况;新兽药名称、来源和特性;
(三)临床试验方案原件一份;
(四)委托试验合同书正本一份;
(五)试验承担单位资质证明复印件一份;
(六)本办法第四条规定的有关资料一份;
(七)试制产品生产工艺、质量标准(草案)、试制研究总结报告及检验报告;
(八)试制单位《兽药GMP证书》和《兽药生产许可证》复印件;
(九)使用一类病原微生物的,还应当提交农业部的批准文件复印件。
属于生物制品的新兽药临床试验,还应当提供生物安全防范基本条件、菌(毒、虫)种名称、来源和特性方面的资料。
属于其他新兽药临床试验,还应当提供农业部认定的兽药安全评价实验室出具的安全性评价试验报告原件一份,或者提供国内外相关药理学和毒理学文献资料。第九条 属于生物制品的新兽药临床试验,应当向农业部提出申请;其他新兽药临床试验,应当向所在地省级人民政府兽医行政管理部门提出申请。
农业部或者省级人民政府兽医行政管理部门收到新兽药临床试验申请后,应当对临床前研究结果的真实性和完整性,以及临床试验方案进行审查。必要时,可以派至少2人对申请人临床前研究阶段的原始记录、试验条件、生产工艺以及试制情况进行现场核查,并形成书面核查报告。
当前在评估塑料生物可降解性时,一般会按照欧盟的EN 13432或澳大利亚的AS 5810标准评估体系对塑料制品进行试验评估。该评估体系包括四个方面的试验:重金属和其他有毒有害物质试验、生物分解性能试验、崩解程度试验、生态毒性试验。
塑料制品即使通过了重金属和有毒有害物质测试、测定了生物分解性能和崩解性能,我们仍然无法确定塑料制品崩解后的残余土壤是否能无害的进入大自然、是否能够环境可持续地用于农林牧业的种植、养殖生产活动。因此,生态毒性试验则是一个对崩解后土壤进一步确认其对生态环境是否具有毒性的测试。
澳大利亚的AS 5810标准认为,必须要同时考虑崩解过程中由于微生物降解代谢产生的代谢产物的影响,因此AS 5810要求不仅要进行植物毒性试验,还要进行动物(蚯蚓)急性毒性试验。该试验方法用于评价在人工土壤中施用崩解后土壤之后对指定品种蚯蚓存活的影响。
相关测试标准
OECD 207ASTM E1676
测试原理
将指定品种、数量、体重的蚯蚓置于精确定义的人工土壤与不同浓度系列供试品的混合土壤中,在受控光照和温度条件下进行生息,最终在第7天和第14天评估蚯蚓的存活率、蚯蚓在行为和病理症状上的现象以及记录土壤中水分含量、pH等参数的变化情况。测试有效性在试验结束时,对照组中蚯蚓的死亡率不超过10%。
测试条件
温度:20±2℃光照:400~800 lux
测试设备
一般常用专门的蚯蚓急性毒性测试仪(RTK 207)进行测试。