芝麻是小籽作物，正常播种量情况下每亩可出苗数万至十余几万，这些苗子在生长过程中如不及时间苗，很容易出现苗挤苗、苗荒苗的问题。及时间苗、定苗，是获得高产的主要措施。
第1次间苗宜早，一般在幼苗出现1对真叶时间第1次苗，在第2～3对真叶出现时间第2次苗。如果田间有部分缺苗，在间苗时预留一些生长健壮的幼苗作补苗用。芝麻一般在3～4对真叶时定苗。定苗不要太早，否则遇到病害或虫咬，易发生缺苗；但定苗过晚，常造成植株徒长，形成高脚苗。在病、虫等自然灾害严重的年份和地方，应适当增加间苗次数，待幼苗生长较为稳定时，再行定苗。如果为了早定苗，可于定苗前撒毒饵防止地老虎等害虫危害。
间苗、定苗的原则是“密留稀，稀留密，不稀不密留壮的”，是说出苗多时多间苗，出苗少时多留苗，出苗不多不少时则选留大苗。通常间苗、定苗是结合中耕进行的，第一道破苗，将成团的苗破开；第二道疏苗，将弱苗劣苗去除，留好预留苗；第三道定苗，按计划密度留好壮苗，缺苗的地方带土移栽补齐。
